P-nikotiinamidimononukleotidin (NMN) tuotanto Escherichia colissa

Abstrakti

Diabetes on krooninen ja etenevä sairaus, jonka levinneisyys kasvaa jatkuvasti ja kasvaa taloudellisia paineita maailmanlaajuisiin terveydenhuoltojärjestelmiin. Äskettäin insuliiniresistenssi, tyypin 2 diabeteksen tunnusmerkki, parani hiirillä, joita hoidettiin NAD ⁺ -esiasteen β-nikotinamidimononukleotidilla (NMN) , eikä toksisia vaikutuksia ilmoitettu. NMN: llä on kuitenkin korkea hintamerkki, tarvitaan kustannustehokkaampia tuotantomenetelmiä. Tämä tutkimus ehdottaa bioteknologisen NMN: n tuotantomenetelmää Escherichia colissa . Osoitamme, että rekombinantin nikotinamidifosforibosyylitransferaasin (Nampt) ja fosforibosyylipyrofosfaatti (PRPP) -syntetaasin bicistronic-ilmentyminen nikotiinamidin (NAM) ja laktoosin läsnä ollessa voi olla menestyksekäs strategia kustannustehokkaalle NMN-tuotannolle. Proteiiniekspressiovektorit, joissa oli NAMPT-geeni Haemophilus ducreyista ja PRPP-syntetaasi Bacillus amyloliquefaciensista, joilla oli L135I-mutaatio, transformoitiin Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS: ään. Näissä soluissa, jotka oli kasvatettu PYA8-elatusaineessa, jota oli täydennetty 0,1% NAM: lla ja 1% laktoosilla, NMN-tuotanto saavutti maksimiarvon 15,42 mg bakteeriviljelmän litraa kohti (tai 17,26 mg proteiinigrammaa kohti).

esittely

Kansainvälisen diabeteksen liiton mukaan tyypin 2 diabetesta sairastavien aikuisten lukumäärä oli 425 miljoonaa vuonna 2017, ja sen odotetaan nousevan 649 miljoonaan vuoteen 2045 mennessä. Maailmanlaajuisesti 12% terveydenhuollon budjetista (tai 727 miljardia dollaria) käytetään diabeteksen hoidosta. Viimeaikaiset tutkimukset yhdistivät insuliiniresistenssin, tyypin 2 diabeteksen tunnusmerkin, mitokondrioiden toiminnan heikkenemiseen ja vähentyneisiin NAD ⁺ -tasoihin sekä NAD ⁺ / NADH-suhteeseen, joita havaittiin myös ikääntyessä. NAD ⁺ on läsnä kaikissa elävissä organismeissa ja se on tunnettu koentsyymi hapettumisen-pelkistysreaktioissa. NAD ^{+: sta} riippuvat proteiinideasetylaasit, kuten SIRT1 ja SIRT6, toimivat metabolisina antureina ja säätelevät alavirran reittejä, jotka lopulta palauttavat mitokondrioiden toiminnan ja insuliiniherkkyyden. Tämä havainto laajentaa NAD ⁺ -vaikutusten tutkimusalueen muihin ikääntymiseen liittyviin rappeuttaviin sairauksiin, kuten: sydän-, verisuoni-, syöpä, niveltulehdus, osteoporoosi tai Alzheimerin taudit.

Β-nikotiinamidimononukleotidi (NMN) on NAD ⁺ -biosynteesin välituote, joka on tuotettu nikotinamidista (NAM) ja fosforibosyylipyrofosfaatista (PRPP) nikotinamidifosforibosyylitransferaasientsyymin (Nampt) avulla (EC 2.4.2.12). Koska NMN oli hyvin siedetty, eikä siinä ilmoitettu sivuvaikutuksia hiirien pitkäaikaisen annon aikana ja estäen ikään liittyvää fysiologista heikkenemistä, NMN osoittautui tehokkaaksi hoitamalla runsasrasvaisen ruokavalion aiheuttamaa tyypin 2 diabetestä kääntämällä ikääntymiseen liittyvät mitokondriohäiriöt ja pelastamalla ikään liittyvän heikentyneiden hermosolujen vähenemisen vaikutus.

NAM muunnetaan yleensä NMN: ksi NAD ^{+: n} pelastusreitteihin osallistuvien entsyymien, kuten Nampt, avulla. Tämän entsyymin vaikutus muodostaa pääasiallisen NAD ⁺ -anabolisen aktiivisuuden solussa. Nisäkkäiden tai mikro-organismien nukleotidien metabolian ja biosynteesin säätely etenee yleensä kuluttamalla PRPP: tä. PRPP johtuu riboosi-5-fosfaatista pentoosifosfaattipolun sekä oksidatiivisten että ei-oksidatiivisten haarojen kautta.

Bakteereissa NAM muuttuu useimmiten nikotiinihapoksi (NA) nikotiinamidaasilla, joka on integroitunut Preiss-Handler -reitille, tämä koskee myös Escherichia colia . Nisäkkäillä nikotinamidaasiaktiivisuutta ei ilmoitettu; NAM muunnetaan sen sijaan NMN: ksi yhdellä NAM-fosforibosyylitransferaasientsyymeistä. Vaikka suurimmasta osasta bakteereista puuttuu NAM-fosforibosyylitransferaasi, entsyymi ekspressoituu Haemophilus ducreyissa ja Shewanella oneidensisissä .

Yksinkertaisia ja metabolisesti monipuolisia organismeja, kuten Escherichia coli , käytetään usein biotekniikassa proteiinien hallittuun ilmentämiseen, joilla on haluttu entsymaattinen aktiivisuus. Tällaisia entsyymejä koodaava DNA viedään usein bakteereihin ekspressiovektoreilla, kuten Novagenin pET-järjestelmä. PET-vektorit transformoidaan bakteereissa, jotka ekspressoivat T7 RNA -polymeraasia, kuten E. coli BL21 (DE3). Entsyymien ilmentymisen hallinta saadaan aikaan käyttämällä lac- promoottoria, joka aktivoi ekspression vain laktoosin (myös metaboloituneena hiililähteenä) tai sen synteettisen rakenneanalogin, isopropyyli-1-tio-β-D-galaktopyranosidin (IPTG) läsnä ollessa ( ei metaboloitu, jatkuvalla pitoisuudella kasvatusprosessin aikana). Koska bakteerien aineenvaihdunta on monipuolista, hiililähteen vaihtelut ja keskipitkällä täydennettyjen entsyymisubstraattien konsentraatio ovat avaintekijöitä, jotka on otettava huomioon bioteknologisessa prosessissa.

Pyrkiessään vastaamaan NMN: n nykyiseen korkeaan hintaongelmaan ehdotimme aikaisemmassa työssämme puhdistusmenetelmää bakteerisoluista. Prosessin edelleen optimoimiseksi, koska pystyimme löytämään vain yhden julkaistun hiivantuotantomenetelmän, tässä tutkimuksessa ehdotetaan yksinkertaista ja kustannustehokasta NMN: n bioteknologista tuotantomenetelmää Escherichia colissa .

tulokset

Bakteerimuutos

Haemophilus ducreyista, NadV: stä, Shewanella oneidensis MR-1: stä ja Nampt: sta Mus musculus oletetulle NadV: lle generoidut monien aminohapposekvenssien kohdistus osoittavat suurta samankaltaisuutta (kuva S1), mikä tekee kaikista näistä entsyymeistä ehdokkaita bioteknologiseen prosessiin.

Muunnettu E. pET28a (+) -plasmidien kuljettamat nadV (NAMPT) -geeneillä varustetut coli- solut muodostivat pesäkkeitä kanamysiinillä täydennetyillä LB Agar -levyillä. Transformoimattomilla bakteerisoluilla inokuloiduilla maljoilla ei havaittu pesäkkeitä. Näistä pesäkkeistä eristetyn plasmidi-DNA: n agaroosigeelielektroforeesi vahvisti Nampt-PET28a-, pET28a-soNadV- tai pET28a-hdNadV-plasmidien läsnäolon E: ssä . coli DH5a (lisäkuvio S2A, kaista 2, 3, 4). DNA-nauhat vastasivat E: n nauhoja. coli BL21 (DE3) pLysS-solut (lisäkuvio S2A, kaista 6, 7, 8), jotka transformoitiin vastaavilla plasmideilla, jotka uutettiin suoraan E: stä . coli DH5a. Transformoimattomassa E: ssä . coli BL21 (DE3) pLysS -solut, joita käytettiin negatiivisena kontrollina, pLysS-plasmidin läsnäolo varmistettiin elektroforeesilla, nauha, joka vastasi tunnettua 4886 bp: n pituutta (lisäkuvio S2A, kaista 5), osoitettiin agaroosigeelillä.

(Lisätietoja kokeellisista tiedoista on alkuperäisessä verkkosivustossa: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)